飲用水安全評價指標——Vero細胞培養法
飲用水安全是一個國家和地區發展水平和生活質量的重要標志，而我國不僅人均水資源擁有量只有世界平均水平的四分之一，而且隨著經濟建設的快速發展，水污染形勢依然嚴峻，越來越多的化學物質在生產、運輸和使用過程中將不可避免地進入飲用水源，而各種新材料在飲用水行業的使用也可能造成其中微量化學物質的溶出，這些因素使得目前飲用水中化學物質種類不斷增多，對人體健康和生態環境造成了日益嚴重的危害，因此，其安全評價具有重要意義。
由于飲用水中化學物質具有種類繁多，濃度極低的特點，單一的理化指標無法反映水體中各類物質的協同效應。傳統的生物試驗法，如魚類試驗和蚤類試驗，因靈敏度較低，達不到檢測痕量化學物質的要求。近年來興起的一些基于分子水平和細胞水平的方法，如發光細菌法和遺傳毒性法，被廣泛用于飲用水及相關材料(浸泡液)毒性物質的檢測。本文根據有關材料系統介紹了現有飲用水及相關材料安全評價技術的原理、過程和應用，分析了各種檢測方法的優點和不足，提出發展依據細胞形態變化的Vero細胞培養法——一種生物安全評價技術的原理、過程和應用，以為大家提供一種廣譜、可靠、靈敏、簡單易行的綜合測試技術。
盡管儀器法的發展使飲用水中微量物質的檢測變得更加方便、快速，但檢測成本偏高，并且由于水中各種化學物質之間的協同作用，單一的理化指標無法反映飲用水的綜合毒性。傳統的生物試驗法(如魚類、藻類試驗法)可以檢測水體的長期和綜合毒性，但其靈敏度較低、所需時問長，不適于飲用水的安全評價。從20世紀80年代以來，隨著現代生物技術的快速發展，生物體(特別是微生物)中一些分子與細胞水平的變化被用作衡量水體安全的指標，并以此為基礎建立了一些快速、靈敏的檢測和評價水體生物毒性的技術。
Vero細胞培養法英國于20世紀90年代，逐步發展和完善了一種細胞毒性檢測法——Vero細胞培養法，以用于飲用水及相關材料的綜合安全評價。該法的原理是利用來源于非洲綠猴腎臟的Vero細胞(CCL一81)在正常情況下生長時，呈不規則三角形狀；而在含一定濃度有害化學物質的培養基中生長時，則由三角形轉變為圓形或橢圓形的特點來判斷飲用水及相關材料的綜合安全性(材料的安全性評價通過測定材料浸泡液的綜合生物毒性進行)。
Romem用Veto細胞測試氯化汞的毒性，并確定了能夠檢測到毒性的氯化汞的濃度范圍。Fernandez采用Vero細胞的形態學分析和生化分析確定了五氯苯酚對哺乳動物細胞的毒性已有研究表明，很低濃度的有害化學物質就可造成Vero細胞變形(高濃度造成細胞死亡或繁衍速度下降)，因此，其反應靈敏度極高，而且對不同性質化學物的反應具有普遍適用性(重金屬離子、極性與非極性有機物的超標都可造成細胞變形)。同時，非洲綠猴腎臟的Vero細胞與人體細胞高度同源，檢測時間僅需48h因此，該方法是一種理想的飲用水綜合安全評價手段。
Vero細胞變形試驗可分為三個階段，(1)在實驗條件下建立和維持Vero細胞系生長；(2)將受試水樣或飲用水相關材料的浸提液配制一批細胞培養基；(3)進行受試樣品的細胞毒性試驗，觀察細胞形態變化。(1)試驗水(Testwater)必須是不含有余氯的，這樣以免對細胞系的生長產生毒害和抑制；(2)試驗材料(testsample)需要用試驗水清洗10min，去處其表面的雜質，以免對試驗結果造成影響；(3)將清洗過的一定表面積的試驗材料放人試驗容器(Testcontainer)中，用試驗水在23℃避光條件下浸泡24h；(4)進行材料浸泡液的Vero細胞毒性試驗——配制含有不同劑量浸提液的培養基，準備細胞懸浮液，接種到培養皿中的細胞濃度在l03—105個/m2，以確保細胞對污染物較高的靈敏度，在CO2培養箱中37℃培養24～48h，然后在低倍光學顯微鏡下觀察細胞形態；(5)如果培養皿表面能形成一個相互融合的、生長良好的細胞單層，則說明材料浸提液對細胞無毒性反應，實驗結束；(6)如果材料浸提液對細胞的形態產生了影響(細胞變圓、無細胞單層)，那么應該對另外兩個平行樣再進行細胞毒性試驗；(7)如果在兩平行樣的毒性試驗中，都能形成一個相互融合的、生長良好的細胞單層，則說明材料浸提液對細胞不產生毒性反應，實驗結束；(8)如果另兩平行樣品中仍有一個對細胞形態產生了影響(細胞變圓、無貼壁的細胞單層)，則說明材料浸提液對細胞產生毒性反應，實驗結束。
他們考察了2，4，6一三氯苯酚(TCP)和飲用水相關材料(PVC管和一次性塑料水杯)的浸泡液致Vero細胞變形的靈敏度與相關性，并與四氮甲唑藍(MTF)比色法進行了比較。結果表明：TCP對Vero細胞的毒性響應濃度為0.5mg／L，且變形細胞的比例與TCP濃度呈正相關，而MTY比色法測定低濃度TCP(<1.0mg/L)致Vero細胞增殖抑制率的結果不穩定；流式細胞儀AN—NEXINV—FITC／PI雙染色法的檢測結果顯示，細胞膜損傷是Vero細胞毒性的早期表現特征，比細胞凋亡和壞死更靈敏；Vero細胞暴露于飲用水相關材料的浸泡液時，其變形細胞的比例隨浸泡溫度的升高而增加，而在相同條件下，MTF比色法測定的浸泡液對Vero細胞的增殖抑制率則呈現不規律變化。
他們以2,4，6一三氯苯酚(2，4，6一trichlorophenol，TCP)為例，采用MTF比色實驗和ANNEXIN V—FITC／PI雙染色一流式細胞技術研究了Vero細胞對有機化學污染物的毒性響應特征和敏感性，以期發現一種靈敏、可靠的表征微量化學物質綜合毒性的方法．研究結果表明：1)TCP濃度對Vero細胞的毒性響應特征有決定作用。低濃度TCP(≤0．5mg·L-)即可使部分細胞從原有的剛性不規則三角形結構變為圓形或橢圓形，但細胞的生長未受明顯抑制．TCP濃度在1～5mg·L-時，細胞生長開始受到抑制，表現為細胞增殖受到抑制及部分細胞凋亡或死亡，但增殖抑制率和TCP濃度之間的關系不明顯．當TCP濃度大于5mg·L-時，細胞增殖明顯受到抑制，且隨TCP濃度的增加，細胞增殖抑制率逐漸升高．2)TCP作用時間對Vero細胞的毒性響應特征有顯著影響。ANNEXIN V—FITC／PI雙染色一流式細胞儀檢測結果表明，TCP作用24h內Vero細胞毒性表現為以細胞膜的完整性受到損傷為主，凋亡或壞死細胞比例較小；而48h后，凋亡細胞的比例明顯增加．細胞復壯實驗結果進一步證實24h內形態發生變化的細胞并未完全壞死或凋亡。以上結果表明細胞形態變化和細胞膜損傷均為細胞毒性的早期表現特征，兩者之間可能存在某種相關性，以此表征化學污染物的生物毒性具有較高的靈敏度，值得進一步研究。
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