高選擇性重組基因工程菌治理含汞廢水

更新時間：2008-11-19 15:19 來源：作者: 閱讀：1621

1 實驗材料

實驗中所用的菌株為廈門大學化學工程與生物工程系生物工程實驗室利用大腸桿菌E.coliBL21(DE3)為宿主菌，經帶有汞操縱子基因和金屬硫蛋白編碼基因的重組質粒轉化而得到的基因工程菌。汞操縱子基因在細胞膜處表達出高特異性的外膜汞結合蛋白和內膜汞轉運蛋白，同時金屬硫蛋白基因在細胞體內表達出對重金屬有高結合能力的金屬硫蛋白。金屬硫蛋白是一組富含巰基的低分子量蛋白質，它既可高容量地結合重金屬離子，又可在細胞體內消除重金屬離子對細胞本身的毒害作用。為便于重組菌株的篩選，在重組質粒中引入了氨芐(Amp)和卡那(Kan)兩種抗生素選擇性標記。

基本培養基為LB培養基(g/L)：蛋白胨10.0；酵母提取物5.0；NaClO。

2 實驗方法

2.1菌種保存

        在500mL搖瓶中將重組菌接種到200mL含50mg/L氨芐霉素和30mg/L卡那霉素的LB培養基中，在37℃下振蕩培養至OD₆₀₀約為4(振蕩速率為170min)，在1.5mL無菌微型離心管中加入870 L細菌培液中和130 L88%的甘油，混合后用液氮速冷，然后保存在-80℃。

2.2汞離子的生物富集

        在l000mL搖瓶中裝入300mLLB培養液，加入50mg/L氨芐霉素和30mg/L卡那霉素，然后接入lmI細菌～甘油培養液，在37℃下振蕩(振蕩速率為170rain)培養至過夜.取少量菌液接種到相同的LB培養液中，使初始菌體密度為OD400值0.1～0.3，37℃下振蕩培養至OD6000.5～0.7時添加誘導物異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1.0mM.再次振蕩培養4h，4℃下離心收獲菌體待用.菌體在使用前先用磷酸緩沖液洗滌，然后懸浮于含不同濃度汞離子的模擬電解廢水中，在37℃下振蕩培養1h，離心收集菌體。為測量菌體內所富集的汞離子含量，將收集的菌體干燥后用70%的高純度硝酸溶液消化過夜。考察富集速率時，在不同的時間用0.2 m孔徑的醋酸纖維膜收集菌體，以使菌體和處理液盡快分離開來。由于重金屬離子易于被容器器壁吸附而導致實驗誤差，實驗中所用的所有導管和玻璃容器使用前都用20%的硝酸溶液浸泡過夜，然后用去離子水浸洗干凈。

3 結論

        經重組基因轉化的基因工程菌具有很強的從廢水中富集汞離子的能力。廢水中共存離子的存在加快了重組菌的富集速率，但卻導致菌體的平衡富集能力下降了30%。pH的變化對重組菌的富集行為影響很小，且重組菌對汞離子的富集能力比一般的生物吸附法有很明顯的提高。